*****(중요)
BCL-2 family에 의한 세포사멸의 조절 : 생리와 병리에 대한 영향
삼중의 BCL-2 세포사멸 스위치
BCL-2 family 단백질은 구조적 유사성을 보이는 BH domain들을 가지고 있다(그림 2a).
구조 와 서열의 유사성을 고려하여
1)여섯 가지 pro-survival family member인 BCL 2, BCL XL, BCL W (BCL2L2), MCL1 (myeloid cell leukaemia sequence 1), A1 (BFL1)과 BCL B (BCL2L10) 뿐만 아니라
2) proapoptotic effector 단백질인 BAX, BAK와 BOK (BCL 2 related ovarian killer protein)이 4개의 BH domain을 공유하며 중앙의 소수성 core helix (α5)를 helical bundle이 둘러싸고 있는 globular구조와 유 사하다.
이러한 접힘이 α-helix 2, 3, 4와 5에 의해 표면에 소수성 groove를 만들어낸다.
. 이 groove가BIM (BCL 2 interacting mediator of cell death; BCL2L11)과 같은 BCL 2 family의 pro-apoptotic의 BH3 domain과 상호작용하는 중추적 접점이 되는 것으로 여겨진다. 이 상호작용은 우선적으로 세포내막, 특히 미토콘드리아의 외막에서 일어나며 대부분의 family member가 carboxy-terminal의 소수성 막 투과(transmembrane) domain에 의해 조절된다.
2.1 BCL-2 family member들 간의 상호작용
세포독성 자극 신호를 받아 전사 혹은 번역 후 조절에 의해 유도되는 BH3 only 단백질들은 pro-survival BCL 2 family 단백질을 중화시키거나 pro-apoptotic effector인 BAX 와 BAK을 직접적으 로 활성화시키는 2가지 메커니즘으로 pro-apoptotic 기능을 수행한다. pro-survival BCL 2 family 단백 질의 중화는 구조적으로나 기능적으로 많이 알려져 있으며 이러한 정보는 이 단백질들을 표적으로 한 새로운 치료법의 발전에 대한 정보를 지닌다.
BH3 only 단백질들의 BH3 양친매성 helix는 pro-survival 단백질의 소수성 groove와 결합 할 때 4개의 소수성 잔기 (h1-h4)를 groove의 소수성 pocket에 넣고 BH3의 Asp잔기와 pro-survival 단백질 BH1 domain의 Arg 잔기 사이의 salt bridge를 형성한다. 그러나 mutant 연구들은 표면 전체의 상호작용이 결합에 기여한다는 것을 보여준다. BH3 domain들, pro-survival 단백질의 groove들의 미묘한 차이들 때문에 몇 BH3-only 단백질(BAD나 NOXA 같은)은 pro-survival 단백질들에 선택적으로 억제하지만 BIM, tBID, PUMA 같은 다른 BH3- only 단백질들은 모든 pro-survival 단백질을 억제한다(그림 2b).
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세포사멸 스위치 조절에 관한 모델 BCL-2 family member들 간의 상호작용이 어떻게 세포사멸 스 위치를 조절하는지를 세가지 모 델을 통해서 보여준다. 직접적 활성화 모델에서는 tBID, BIM, PUMA 같은 BH3-only 단백질이 pro-apoptotic effector인 BAX, BAK의 활성화에 직접적으로 관 여한다(a). 이 복합체의 상호작용 이 일시적이기 때문에 복합체의 관찰은 쉽지 않지만 BAX가 BIM, BID 같은 BH3 peptide와 함께 liposome을 투과성이 높도록 만들 수 있다. 이런 직접적인 활성화 기능이 없는 BAD 같은 BH3-only 단백질들은 pro-survival BCL-2 family member와의 결합을 통해 BH3-only activator 단백질이 방출되도록 도와 증감제의 역할을 한다.
반면 직접적 활성화 모델에서 BCL-2 같은 pro-survival 단백질들은 BH3-only 단백질들을 우선적으로 격리 시키고 간접적 활성화 모델에서는 pro-survival 단백질들이 BH3-only 단백질뿐 아니라 활성화 되어 BH3 domain이 노출된 BAX 또는 BAK도 격리시킨다.
이 모델에서는 BAX와 BAK이 낮은 확률로 자발적으로 활 성화 되거나 알려지지 않은 변형 등 다양한 방법으로 활성화 된다. 이 모델은 모든 pro-survival 단백질들 이 BH3-only 단백질이나 BH-3 mimetics에 의해 중화된다면 BAX와 BAK이 미토콘드리아 외막의 투과성을 증가시키는 것으로부터 자유로워진다는 것을 강조한다. 최근에는 직접적, 간접적 활성화 모델 모두 다양한 상황에 적용될 수 있는 것으로 생각된다. 따라서 통합 모델(c)은 pro-survival 단백질들이 BH3-only 단백질들(mode 1)뿐만 아니라 활성화된 BAX와 BAK (mode 2) 도 격리시킬 수 있다는 것을 보여준다. |
Pro-survival 단백질들은 활성화된 BAX와 BAK의 BH3 domain과도 결합할 수 있으며 이들의 pro-apoptotic 능력을 억제한다. 모든 pro-survival 단백질들은 BAX와 결합해서 억제하는 것으로 보 이지만 BAK은 주로 MCL1, A1, BCL-XL에 의해서 억제되는 것으로 보인다(그림 2c).
Pro-survival 단백 질이 BAX 또는 BAK의 BH3 peptide와 이룬 complex의 접점이 BH3 only 단백질들의 BH3 peptide와 이룬 complex의 접점과 매우 유사하다. 이는 세포사멸 조절의 간단한 경쟁적 모델을 제시하는데 증 가된 BH3-only 단백질이 활성화된 BAX나 BAK의 억제를 극복한다는 것이다.
상호배타적이 아니라 대안적으로 모델(BOX 1)은 pro-survival 단백질들이 BAX와 BAK을 직접적으로 활성화 시킬 수 있는 BH3-only 단백질을 중화하여 세포사멸을 예방할 수 있다는 것을 보여준다.
2.2 BAX와 BAK의 활성화
건강한 세포에서 BAK은 미토콘드리아의 외막에 자신의 transmembrane domain (α9)을 박은 상태로 존재한다. 대조적으로 BAX는 자신의 transmembrane domain을 canocical 소수성 groove에 접어 넣은 상태로 세포질에 우선적으로 존재하지만 세포독성 신호가 BAX를 미토콘드리아에 축적되 는 것을 촉진한다. 최근의 증거들은 정상의 세포에서 BAX가 주기적으로 미토콘드리아 외막으로 이 동하지만 BCL-XL과 같은 pro-survival 단백질들과의 결합에 의해 다시 세포질로 다시 돌아간다는 것 을 보여준다. 그렇기 때문에 세포사멸 동안 미토콘드리아에 BAX가 증가하는 것은 BAX가 BH3-only 단백질에 의해 세포질에서 활성화됐다는 것, 또는 단순히 미토콘드리아에서부터 BAX가 역이동하는 등의 균형의 변화가 생겼다는 것을 반영한다. 세포사멸 동안에 BAX와 BAK은 그들의 구조가 pro-survival 단백질들과 접힘이 비슷한 불활 성의 monomer에서 미토콘드리아 외막을 통과할 수 있는 homo-oligomer로 바뀐다. 이러한 변화가 BIM 이나 tBID 같은 activator BH3 only 단백질에 의해 이뤄질 수도 있고 그들의 BH3 peptide에 의 해서도 가능하다. BAX는 pro-survival 단백질과 상동인 canocical 소수성 groove, 그리고 BAX의 반대 편의 대체되는 자리의 2개의 구별되는 활성화 자리를 가진다.
2.3 BAX와 BAK의 killer로의 변환
세포가 세포독성 자극을 받으면 BAX와 BAK은 N terminal 잔기의 노출과 이웃한 BAX 또는 BAK 단백질의 groove에 삽입되기 전 BH3 domain의 일시적인 노출을 포함하는 초기 구조적 변화가 일어난다. Activator BH3 domain에 결합된 BAX의 구조는 BH3 domain 근처에 불안정화 구멍을 만들 고 이는 아마도 BH3 domain의 밀어냄을 촉진시킬 것으로 생각 된다. 구조 또한 BAX가 α2–α5를 함 유한 ‘core’ domain과 α6–α8으로 구성된 ‘latch’ domain으로 재배열 한다는 것을 보여준다(그림 3. step3).
BAX와 BAK oligomer 사이의 접점에 대한 몇 가지 모델들 중에서도 가장 지지 받는 모델은 2개의 활성화된 BAK(혹은 BAX)분자가 각각 자신의 BH3 domain을 서로 다른 분자의 canocical groove에 집어넣어 새로운 ‘대칭적’ dimer를 이룬다는 것이다(그림 3, step 4). BAX와 BAK oligomer가 어떻게 맞물리며 미토콘드리아 외막에 구멍을 뚫는지는 알려지지 않았지만 BAX core BH3 in groove symmetric dimer가 α4와 α5 chain의 표면에 다양한 아로마틱 잔기를 노출하고 있다는 것이 분명해 보인다(그림 3, step 5). 만약 이 잔기들을 미토콘드리아 외막의 지질 머리 그룹 사이에 넣고 있다면 외막의 부피가 초과되는 결과를 낳아 막의 tension과 curvature를 증가된다. 이는 지질 이중층의 파 괴를 촉진할 수 있으며, proteolipidic pores를 형성할 수 있다. 최근 연구는 BAK의 상당한 정도의 oligomerization이 pore형성보다 선행되며, oligomer mass가 pore 크기를 결정한다는 것도 보여주었다.
3. BCL-2 family를 조절하는 신호들
BCL-2 family protein들은 phosphorylation과 ubiubiquitylation 같은 번역 후 조절이 많이 일 어난다. BCL-2의 Ser70혹은 몇몇 다른 loop 잔기가 phosphorylation되면 loop conformation을 바꾸 고 이는 BCL-2의 BAK과 BIM에 대한 결합을 상당히 증가시키고 세포를 화학치료제에 더 반응하지 않도록 만든다. MCL1은 transcription, translation과 protein turnover가 엄격한 조절을 받는다. MCL1은 ubiquitin-independent pathway로 분해되기도 하며 β-transducin repeat-containing protein (βTrCP)와 F-box, WD40 domain-containing 7 (FBW7; also known as FBXW7)과 같은 여러 ubiquitin ligase들에 의해 분해 되며 반대로 deubiquitylase USP9X29에 의해 안정화 되기도 한다. MCL1의 N-terminal region 역시 자신의 안정성에 영향을 준다. N-terminal을 삭제하면 MCL1의 isoform을 만들어내며 mitochondrial matrix에서 발견되고 미토콘드리아의 구조와 기능에 영향이 있다. BH3-only protein들은 다양한 방법으로 조절된다. PUMA와 NOXA 의 transcription은 p53에 의해 조절되지만 transcription은 p53 independent 방법으로 증가될 수 있다. BH3 only protein들은 Post-translational modification도 흔하게 일어나는데 caspase8은 BID를 활성화 tBID로 진행시킨다 (FIG. 1). BAD는 phosphorylation 되면 14-3-3에 의해서 cytosol에 고립되지만 대부분의 BH3-only protein의 phosphorylation의 생물학적 효과는 여전히 논란이 되고 있다.
4. 정상 생리환경에서의 BCL-2 family
BCL-2 family member들이 mitochondrial 분열과 결합, autophagy와 미토콘드리아 기능을 포 함한 non-apoptotic 과정에도 참여한다는 것은 여러 연구를 통해서 밝혔지만 생리학적 증거들은 여 전히 부족하다. 4.1 Pro-survival 단백질 유전자이식 생쥐에서 pro-survival BCL-2 family member가 과발현 되면 많은 세포 종류들을 다양한 apoptotic 자극에 저항성을 가지도록 만든다. BCL-2 손실은 신장의 epithelial progenitor 세포 의 죽음에 의해 치명적인 다낭포성 신장질환(polycystic kidney disease)을 초래하며 성숙한 림프성 세포와 melanocyte progenitor가 감소한다. 놀랍게도 이와 동시에 BH3 only protein BIM이 제거되면 이 모든 결함을 회복한다. BCL-XL deficient 생쥐는 태아의 적혈구 형성 결함과 뉴런 소모로 인해 낭 배형성 14일째 근처에서 죽는다. BCL-W 결함 생쥐는 오직 정자생성에만 결함이 있는데 이는 아마 세르톨리 세포(sertoli cell)들의 죽음에 의한 것으로 보여진다. MCL1의 지속적인 손실은 착상이 못 일어나게 하는데 이는 과도한 세포사멸에 의한 결과인 지는 아직 밝혀지지 않았다. 조건부 MCL1 삭제는 haematopoietic stem 과 progenitor cell 뿐만 아 니라 effector 림프구 등 다양한 세포종류의 survival과 관련 있다. 놀랍게도, 심근세포 (cardiomyocytes)에서 MCL1의 조건부 삭제는 급격하게 심근증(cardiomyopathy)과 심부전(heart failure)을 유발한다. A1의 기능은 불분명하지만 ex vivo에서 A1a 유전자의 손실은 과립구(granulocyte)와 비만세 포의 survival에 영향을 미치며 A1 유전자를 표적으로 하는 shRNA를 발현하는 transgenic 생쥐 역시 림프구 결핍을 보인다.
4.2 BH3 only 단백질
BIM, tBID, PUMA 같은 BH3-only단백질들의 과발현되면 모든 pro-survival BCL-2 family member들을 억제하고 세포사멸을 유발한다(그림 2b). BIM이 제거되면 칼슘 flux와 다른 세포사멸 자극의 조절장애를 일으켜서 림프성 세포와 골수성 세포의 과잉 생산을 초래한다. PUMA와 NOXA는 tumour suppressor 단백질 p53의 직접적인 표적이다. PUMA는 여러가지 세포들, 특히 림프구에서 DNA 손상에 의한 세포사멸에 핵심적인 역할을 하고 NOXA는 림프구의 감 소를 돕고 자외선에 의해 유도되는 섬유아세포 (fibroblasts)와 각질세포(keratinocytes)의 죽음에 큰 역할을 한다. BMF (BCL-2-modifying factor)의 손실에 의해서는 B 세포가 축적되고 글루코코르티코이드 (glucocorticoids)와 다른 pro-apoptotic 자극의 효과에 저항을 가진다. 비록 BIK의 결함이 기형을 나 타내지는 못하지만 BIM이 함께 손실되면 수컷 불임을 유발한다. BAD의 손실은 섬유아세포가 글루코 오스나 사이토카인 결함에 의한 pro-apoptotic 효과에 대해 부분적으로 저항을 나타내기는 하지만 BAD-deficient 생쥐는 일반적으로는 정상이며 혈소판의 수가 조금 증가한다.
4.3 BAX-like 단백질 BAK이 없는 생쥐는 정상처럼 보이긴 하지만 혈소판의 수명이 증가하여 그 수가 증가한다. Bax-/- 생쥐 역시 정상처럼 보이지만 원시생식세포(primordial germ cells)의 생존이 증가하여 수컷 불임이 생긴다. 그렇지만 BAX와 BAK 둘 다 결함이 있는 생쥐는 심각한 기형을 보인다. 대부분 출산 전후에 죽거나 몇 오랫동안 생존하는 생쥐도 임파선염(lymphadenopathy)과 죽음과 직결된 자가면역 질환이 생긴다. 모든 Bax-/- BaK-/- 생쥐는 발에 물갈퀴가 있으며 암컷은 질에 구멍이 없다. Bax-/-BaK-/- 생쥐로부터 유래한 다양한 세포들은 BH3-only 단백질들을 과발현 시켜주는 등의 여러 apoptotic 자극에 저항을 가진다. 따라서 BH3-only 단백질은 BAX와 BAK의 상위에서 작용하며 BAX와 BAK이 있음에도 불구하고 세포사멸을 일으키지 못한다(그림 1).
5. BCL-2 family의 병리적 역할
Mitochondrial 세포사멸 pathway의 결함은 암과 자가면역을 비롯한 여러가지 질병과 관련이 있다. 생쥐에서 BCL-2가 과발현 되면 림프종이 생기고 MYC과 같은 발암유전자들의 발현에 조절이 상이 생겨서 종양형성을 촉진하게 된다. BIM, PUMA, BAD, BMF와 BAX 같은 pro-apoptotic BCL-2 family member들의 손실 역시 종양형성을 촉진한다.
인간에서는 BCL-2의 발현이 증가되어있고 MCL1 혹은 BCLX가 여러 암종에서 증폭되어 있으 며 17%의 외투세포림프종(mantle cell lymphoma)에서 BIM 대립유전자가 둘 다 삭제되어 있다. 그리 고 BIM 또는 PUMA의 발현이 다양한 악성 종양에서 프로모터 과메틸화 등에 의해 억제되어 있다. 자가면역질환을 예방하기 위한 한가지 중요한 사항은 자가반응성 B세포와 T세포의 사멸이다. 그에 따라 생쥐의 B세포에서 BCL-2의 과발현, BIM의 소실 혹은 BAX와 BAK의 손실이 치명적인 자가면역 신장 질환을 극복할 수 있다.
6. 치료 표적으로서의 BCL-2 단백질
암 치료법이 여러 종류의 세포 죽음을 유발하지만 발암성 kinase 억제제와 세포독성물질에 의한 치료효험에는 BCL-2에 의해 조절되는 세포사멸 pathway의 활성화가 가장 핵심적이다. 하지만 이 과정은 여러 암에서 대부분 억제되어있는데 예를 들어 여러 종류의 암에서 일반적으로 나타나는 p53 돌연변이는 PUMA와 NOXA의 유도를 손상시키며 BCL-2의 양이 증가한다.
하지만 역설적으로 대부분의 암들은BH3-only 단백질들의 양이 증가되어 있어 죽을 준비가 되어있다. 예를 들어 prosurvival BCL-2의 발현 양이 높은 림프성 세포들은 증가된 pro-apoptotic BIM을 축적한다. 이러한 사 항을 고려해보면 BH3 domain의 기능을 모방해서 세포사멸을 유도하는 물질(BH3 mimetics)을 찾는 것이 중요해 보인다.
6.1 BH3 mimetic의 가능성과 표적들
ABT-737은 BCL 2, BCL XL, BCL W와 강하게 결합하지만 MCL1, A1과는 결합하지 않는다. 그 래서 이 약물은 MCL1 혹은 A1의 양이 높은 암세포에는 낮은 활성을 나타낸다. 놀랍게도 BCL-2의 발현이 높은 림프성 세포에서 이 약물의 핵심적인 표적은 비어있는 BCL-2가 아니라 BIM-BCL-2 복 합체이다. 게다가 이들 BH3 mimetics는 BIM–BCL XL 혹은 BIM–BCL W 복합체보다 BIM-BCL-2 복합 체를 더 효과적으로 억제하는데 이는 왜 높은 BCL-2 발현이 ABT-737에 대한 민감도를 증가시키는 지 설명한다. 림프성 세포를 죽이기 위해 BCL-2에 ABT-737이 결합함으로 인해 방출된 BIM은 prosurvival MCL1을 중화시키고 BAX 또는 BAK을 직접적으로 활성화시킨다. 초기 임상실험을 통해서 Navitoclax가 혈액암과 소세포폐암(small cell lung cancer), 특히 만 성림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia)에 대한 단독 치료제로서 희망을 보였다. 게다가 최근 임상전의 연구는 navitoclax를 다른 항암제와 같이 처리하면 그 효과를 더 높일 수 있으며 다 양한 고형암(solid tumour)에도 효과가 있다는 것을 보여준다. 많은 기존 약물들이 아마도 navitoclax 와 함께 MCL1의 mRNA와 단백질의 양을 감소시키는데 시너지 효과가 있을 것이다. Navitoclax는 BCL-XL을 억제해서 혈소판의 수명을 조절하기 때문에 용량제한독성(doselimiting toxicity)은 일시적인 혈소판 수의 감소로 나타난다. BCL-2만을 표적으로 하는 BH3 mimetic이 이런 문제들을 예방할 수 있다. 실제로 최근에 개발된 ABT-199는 BCL-2에 선택적이며 실제 만성림 프구성 백혈병 환자에게 투여하였을 때 혈소판 양의 감소는 없이 navitoclax만큼 강한 효과를 보였 다. BCL 2, BCL XL 혹은 MCL1을 표적으로 삼는 화합물들에 대한 구조적 연구는 그들의 결합방 식의 공통점을 강조한다. 모두 P2 소수성 포켓 안에 있는 canonical groove에 박혀있고 ABT 737, ABT 263, ABT 199와 WEHI 539는 P4 포켓으로 확장하여 결합 능력을 증가시킨다(그림 4). P2 포켓이 모든 리간드들의 결합에 핵심적일 것으로 생각된다. BH3 mimetic을 수용하기 위해 P2 포켓이 고유 의 깊은 구명으로 변한다. 그러므로 pro-survival groove들의 가소성이 강력하고 특이적인 리간드를 개발하는데 이용될 수 있다.
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Anti-apoptotic Molecule Bcl-2는 조골 세포와 파골 세포의 분화, 활성화 및 생존을 조절합니다 *
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2794780/?tool=pmcentrez
Apoptosis는 후생 동물의 발달에 필수적이며 포유류의 세포 항상성 유지에 중요합니다. 세포 사멸의 결함은 암,자가 면역 질환 및 퇴행성 질환과 관련이 있습니다 . ( 9 ) Apoptosis는 특정 형태 학적 및 생화학 적 특징을 특징으로하는 프로그램 된 세포 사멸의 한 형태이며 세포 외 자극 및 세포 내 신호 전달 경로에 의해 엄격하게 조절됩니다 ( 10 , – 13). 세포 사멸의 특징적인 형태 학적 특징은 세포질과 핵의 응축을 포함하여 현저한 세포 수축을 초래합니다. 다른 특징으로는 염색질의 올리고 뉴 클레오 좀 크기 단편으로의 뉴 클레오 좀 간 절단 및 원형질막의 블 리빙이 있습니다.
Bcl-2 계열의 단백질은 세포 사멸에 대한 "미토콘드리아"경로를 조절합니다. Bcl-2 ( B - c ell l ymphoma-2)는 원래 B 세포 림프종 ( 14 , 15 ) 의 발병을 유발하는 종양 유전자로 확인되었습니다 . 주로 조혈 세포, 흉선, 간, 신장, 뉴런, 멜라닌 세포, 생식선 및 뼈에서 발현됩니다 ( 16 , – 18). 그것은 미토콘드리아 외막, 소포체 및 핵 외피에 상주하며 미토콘드리아 에서 시토크롬 c 방출을 억제하여 세포 사멸을 억제합니다 ( 19 , 20 ).
Bcl-2 계열은 30 개 이상의 구성원으로 구성되며, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, A1 및 Mcl-1과 같은 항 세포 사멸 단백질
과 pro-apoptotic ( 21 )이 있습니다.
pro-apoptotic family 구성원은 multidomain 구성원 (Bax, Bak 등)과 Bcl homology 3 도메인 전용 구성원 (Bid, Bad, Bim, Bik, Puma, Noxa 등)의 두 하위 그룹으로 나뉩니다.
Bcl 상 동성 3 도메인 전용 패밀리 구성원은 조직 특이 적 분포 패턴을 표시하지만 다중 도메인 pro-apoptotic 구성원은 어디에서나 표현됩니다.
C57BL / 6 유전 적 배경에서 Bcl-2 단백질 - / - 마우스는 출생시 정상 표시,하지만 그들은 곧 6 주령에 도달하기 전에, 다낭성 신장 질환을 개발 번창하지, 대부분의 다이 ( 18 , 22 , - 25 ). Bcl-2 -/- 마우스는 또한 멜라닌 세포 줄기 세포의 과도한 사멸로 인해 두 번째 모낭주기에서 심하게 림프구를 감소시키고 회색으로 변합니다 ( 18 , 24 , 26 ). 골격 조직에서 Bcl-2는 조골 세포, 파골 세포, 연골 세포 및 골 세포에서 발현됩니다 ( 27 , 28). 여러 연구에서 골격 무결성을 유지하는 데 Bcl-2의 중요성이 입증 되었지만 ( 27 , 29 , – 31 ), 조골 세포와 파골 세포에서 Bcl-2의 작용에 대한 분자 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이 연구에서 우리는 Bcl-2 -/- 마우스를 분석 하고 생체 내 및 시험관 내 에서 뼈 형성 조골 세포 및 뼈 흡수 파골 세포에서 항 아폽토시스 성 Bcl-2 단백질의 필수적인 역할을 발견했습니다 .
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암 유형에서 항-세포 자멸사 Bcl-2 서브 패밀리 발현에 대한 조사는 암 치료에서 Bcl-2 길항제의 효능을 예측하는 플랫폼을 제공합니다
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3032312/?tool=pmcentrez
요약
우리는 qPCR 기술을 사용하여 68 개의 인간 암 세포주에서 6 개의 항 아폽토시스 성 Bcl-2 서브 패밀리 구성원 모두의 mRNA 발현 수준을 조사하고 연구 된 종양 세포주 중 36 개에서 세포 사멸을 유도하는 알려진 Bcl-2 억제제의 능력을 측정했습니다.
우리의 연구에 따르면 Mcl-1은 폐, 전립선, 유방암, 난소 암, 신장 암 및 신경 교종 암 세포주에서 가장 높은 mRNA 수준을 가진 항 세포 사멸 성 Bcl-2 아과 구성원을 나타냅니다.
백혈병 / 림프종 및 흑색 종 암 세포주에서 Bcl-2 및 Bfl-1은 각각 가장 높은 수준의 mRNA를 가졌다. 알려진 Bcl-2 억제제의 세포 사멸 특성과 항-아폽토시스 Bcl-2 단백질의 상대적 mRNA 발현 수준 사이의 관찰 된 상관 관계는 Bcl-2 단백질을 표적으로하는 아폽토시스 기반 항암 전략에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.
우리의 데이터는 Bcl-2의 심각한 발현이 백혈병 세포주로 제한되는 것으로 보인다는 점을 감안할 때 클리닉에서 선택적 Bcl-2 억제제의 현재 도전을 설명 할 수 있습니다. 또한, 우리의 데이터는 대부분의 암 유형에서 Mcl-1 억제 또는 흑색 종에 대한 Bfl-1 및 Mcl-1 억제의 조합을 표적으로 한 전략이 Bcl-2만을 표적으로하는 치료보다 더 성공적 일 수 있음을 시사합니다.
프로그램 된 세포 사멸 (세포 자멸사)은 손상되거나 감염된 세포를 제거하고 조직 항상성을 유지하기위한 생리적 과정을 나타냅니다. 1 종양 형성 과정에서 암세포는 항 세포 사멸 단백질의 상향 조절 및 / 또는 proapoptotic 신호 전달 경로의 하향 조절을 통해 세포 사멸을 피하는 능력을 발달시킵니다. 이러한 조치를 통해 일반적으로 세포 독성 반응을 유발하는 화학 요법 또는 DNA 손상 화합물에 감염된 경우에도 암세포가 생존 할 수 있습니다.
Bcl-2 (B- 세포 림프종 / 백혈병 -2) 계열의 pro- 및 antiapoptotic 단백질은 세포 사멸의 중심 조절 자입니다. 26 개 이상의 단백질 군은 기능과 BH (Bcl-2 상 동성) 도메인의 구성에 따라 세 그룹 또는 하위 군으로 나뉩니다. 2
인간에서, Bcl-2 계열의 6 개의 항 아폽토시스 구성원이 확인되었습니다 (Bcl-2, Bcl-x L , Bcl-B, Bcl-W, Bfl-1 및 Mcl-1). 이 단백질은 BH3 전용 단백질과 pro-apoptotic Bcl-2 계열 구성원 Bad, Bak 및 Bax에 결합하여 세포 사멸을 억제 할 수있는 소수성 틈새를 포함합니다. 3
이 결합이없는 경우, proapoptotic Bcl-2 구성원은 외부 미토콘드리아 막 (OMM)으로 모집되어 올리고머 화되고 OMM 투과성을 유발하여 SMAC 또는 cytochrome c 와 같은 proapoptotic 효과기를 방출 합니다. 방출 된 사이토 크롬 c 는 APAF-1 및 pro-caspase 9에 결합하여 apoptosome에서 유래하여 성숙한 caspase 9를 생성하고 proteolytic cascade를 시작하여 궁극적으로 다음과 같이 세포 사멸을 초래합니다.그림 1. 4 한편, SMAC 방출은 IAP (아폽토시스 단백질의 억제제)라고하는 카스파 제 억제 단백질 클래스를 길항하여 아폽토시스 캐스케이드 (그림 1). 암에서 항 아폽토시스 성 Bcl-2 서브 패밀리 구성원 및 IAP 단백질의 약리학 적 억제는 내인성 스트레스 반응이 아폽토시스를 유도하고 종양 퇴행을 유발하는 주요 전략으로 등장했습니다. 5
세포 스트레스 반응에서 Bcl-2 길항제의 메커니즘. 항 세포 사멸 성 Bcl-2 단백질의 과발현은 스트레스 유발 세포 사멸에 대한 암세포 저항성을 유도합니다. ABT-737로 달성 된 바와 같이 항 아폽토시스 성 Bcl-2 서브 패밀리의 하위 집합의 선택적 억제는 유망한 임상 결과를 제공했지만 Mcl-1 또는 Bfl-1의 상향 조절을 통해 극복되는 것으로 나타났습니다. Apogossypol 유도체 인 8Q에 의해 달성 된 바와 같이, 항 아폽토시스 Bcl-2 서브 패밀리의 모든 구성원의 범-활성 억제는 p53 매개 아폽토시스의 억제를 방지하고 다른 서브 패밀리 구성원의 상향 조절을 통해 화합물 저항성을 배제합니다.
Bcl-2의 구조 결정 및 BH3- 결합 틈새의 후속 식별은 항 아폽토시스 성 Bcl-2 서브 패밀리를 표적으로하는 소분자 억제제의 생성을 허용했다. 6 지금까지 Bcl-2 계열을 표적으로하는 거의 모든 치료 화합물은 Bcl-2 및 Bcl-x L 의 억제에 초점을 맞추 었습니다.
이러한 단백질이 A에서 상향 조절된다는 것을 보여준 수많은 면역 조직 화학 (IHC) 연구에 의해 안내되었습니다. 다양한 종양 유형. 7 , 8 , 9 유방암에서이 연구는 Bcl-2와 Mcl-1의 임상 종말점이 다른 상관 관계를 관찰하면서 예후와 Bcl-x L 단백질 수준 사이에 명확한 연결을 만들지 않았습니다 . 7 ,10 CNS 종양 샘플에 대한 이전 연구에서는 IHC를 사용했으며 종양 진행 동안 Bcl-2 및 Mcl-1의 유의 한 상향 조절을 발견했습니다. 9 유사하게, 신장 암 연구에서 환자 샘플의 40 %가 관찰 가능한 Bcl-2 발현 수준을 가졌습니다. 11 전립선 암에서, 이전 연구에서 Bcl-2 과발현이 전립선 암이 안드로겐 독립적 인 형태로 진행되는 것과 관련이 있음을 입증했습니다. 12 더 많은 연구에 따르면 안드로겐 반응 전립선 암 계통 인 LNCaP에서 Bcl-2의 과발현은안드로겐 결핍에도 불구하고 시험관 내에서 지속적인 성장과 생체 내 종양 형성 을 허용합니다. 1364 개의 전립선 선암에 대한 후속 IHC 조사에서 종양 샘플의 25, 100 및 81 %가 각각 관찰 가능한 수준의 Bcl-2, Bcl-x L 및 Mcl-1을 나타냄을 발견했습니다. 14 결장암 샘플에서 Bcl-2 계열 단백질 수준에 대한 연구는 IHC를 사용하여 환자 예후와 Bcl-2 또는 Mcl-1 단백질 수준 사이의 반대 상관 관계를 확인했습니다. 15 , 16 더욱이 난소 암에 대한 IHC 연구는 최근에 Bcl-2 또는 Bcl-x L에 비해 Mcl-1에 대한 더 중요한 역할을 제안했습니다 . 17그룹으로서 이러한 연구는 암 발생에서 항 아폽토시스 성 Bcl-2 서브 패밀리 억제제의 개발 및 사용을위한 확고한 기반을 제공했지만, 주로 환자 유래 샘플을 사용하기 때문에 방법에 대한 추가 연구를 수행 할 수있는 능력을 배제했습니다. 화합물 표적화 개선 및 / 또는 종종 동일한 암 유형 내에서 서로 다른 연구 사이에 매우 다양한 임상 종점이있는 이유를 이해합니다. 18 그러나이 연구들 중 어느 것도 쉽게 이용 가능한 암 세포주 세트에서 6 개의 항 아폽토시스 성 Bcl-2 서브 패밀리 구성원 모두의 상대적 풍부도를 조사하지 않았습니다.
Bcl-2 및 Bcl-x L에 대한 선택적 활성을 갖는 화합물의 임상 시험으로의 진행 은이 문제를 특히 시급하게 만들었습니다. 예를 들어, 여러 전임상 연구에서 Mcl-1을 많이 발현하는 종양은 일반적으로 Bcl-2 및 Bcl-x L 을 선택적으로 표적으로하는 화합물에 내성이 있음을 보여주었습니다 . 19 , 20 따라서 항 아폽토시스 성 Bcl-2 서브 패밀리 구성원 각각의 수준에 대한 포괄적 인 연구는 항 아폽토시스 성 Bcl-2 서브 패밀리 억제제의 더 나은 최적화를 허용 할 수있다.
<참고>
Bcl-2는 형태를 변경하여 Bax 올리고머 화를 억제합니다.
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1478188/?tool=pmcentrez
요약
Bcl-2는 사이토 크롬 c 의 방출을 조절하여 세포 사멸을 억제합니다.및 미토콘드리아의 다른 단백질. Bax의 올리고머 화는 외부 미토콘드리아 막을 투과시켜 세포 사멸을 촉진합니다. 형질 감염된 세포 및 분리 된 미토콘드리아에서, Bcl-2는 tBid 및 Bax와 같은 세포 사멸 작용제에 반응하여 미토콘드리아 막에서 형태 변화를 겪지 만 비활성 점 돌연변이 체 Bcl-2-G145A 및 Bcl-2-V159D는 아닙니다. α5–α6 나선 (Bcl-2-S105C / E152C)의 이동성을 억제하는 이황화 결합을 일으킬 것으로 예상되는 위치에 두 개의 시스테인이 도입 된 돌연변이 Bcl-2는 환원 환경에서만 활성화되었습니다. 따라서, Bcl-2는 일체형 막 Bax 모노머 및 작은 올리고머의 tBid 유도 올리고머 화를 억제하기 위해 형태를 변경해야합니다. 구조적으로 변경된 Bcl-2는 Bax의 통합 막 형태를 격리합니다. Bax가 초과하면 Apoptosis는 Bcl-2가 형태 변화에 의해 그리고 Bax와의 복합체에서 소비됨에 따라 재개됩니다. 따라서, Bcl-2는 미토콘드리아 막의 형태를 변화시켜 막이 삽입 된 Bax 모노머를 결합하고 Bax의 생산적인 올리고머 화를 방지함으로써 미토콘드리아 투과성의 억제제로 기능합니다.
키워드 : apoptosis, Bax, Bcl-2, membrane topology, tBid
소개
Bcl-2는 Bcl-2 상 동성 (BH) 영역 1–3 및 BH3 영역 만 포함하는 단백질을 공유하는 단백질 Bax 및 Bak을 포함하여 proapoptotic family 구성원을 길항하여 세포 사멸을 억제합니다. Bcl-2가 proapoptotic 단백질의 작용을 길항하는 분자 메커니즘은 아직 불확실합니다. 그러나 많은 proapoptotic 단백질이 BH3 영역만을 공유하기 때문에 억제 메커니즘은 Bcl-2 표면의 소수성 BH3 결합 포켓에 의해 매개되는 결합 상호 작용을 포함하는 것으로 생각됩니다 ( Adams and Cory, 1998). 이 모델과 일치하여, 유사한 기능을 가진 가까운 친척 인 Bcl-2와 Bcl-XL은 모두 proapoptotic 단백질에서 파생 된 BH3 펩타이드에 결합합니다. 프로 아폽토시스 단백질과 항 아폽토시스 단백질 간의 결합 상호 작용이 어떻게 조절되는지 정확히 알 수 없지만 용액 연구를 기반으로 BH3 영역을 노출하는 프로 아폽토시스 Bcl-2 계열 단백질의 형태 적 변화를 포함하는 것으로 제안되었습니다. BH3 영역 결합의 결과도 명확하지 않습니다. BH3 영역의 결합시 antiapoptosis 단백질이 비활성화되거나 proapoptosis 단백질로 전환된다는 몇 가지 증거가 있습니다 ( Letai et al , 2002 ).
세포가 세포 독성 자극에 노출 된 후 Bax는 투과성 막 (미토콘드리아 및 소포체)에 의해 세포가 죽도록하기 위해 여러 형태의 변화를 거쳐야한다는 것이 잘 알려져 있습니다 ( Shape et al , 2004 ). 대부분의 경우 초기 아폽토시스 자극은 Bax를 직접 활성화하지 않고 Bid 및 Bim과 같은 하나 이상의 BH3 전용 proapoptotic Bcl-2 가족 구성원의 발현 또는 활동을 증가시킵니다. 이 단백질은 Bax의 형태 변화를 유발하여 세포막으로 이동하여 삽입되도록합니다. 일단 막에 삽입되면 Bax는 올리고머 화하여 막을 투과시키고 사이토 크롬 c 및 SMAC / Diabalo와 같은 세포 사멸의 최종 이펙터의 활성화 제를 방출합니다 (Sharpe 등 , 2004 ; Annis 등 , 2005 ). 우리는 Bax에 의한 막 투과성이 Bax 내부에 묻혀있는 가용성 단백질에있는 나선 9와 두 개의 나선 (5-6)의 막으로의 통합이 선행된다는 것을 보여주었습니다. 올리고머 화 이후 또는 이와 수반되는 기공 형성 도메인을 삽입하는 더 잘 연구 된 박테리아 기공 형성 단백질과 달리, Bax 나선 5-6은 올리고머 화 및 기공 형성 전에 막에 삽입됩니다 ( Annis et al , 2005 ).
우리는 최근 Bax와 유사하게 Bcl-2가 세포가 세포 사멸 자극에 노출 된 후 형태 적 변화를 겪는다고보고했다 ( Kim et al , 2004 ). Bax와 달리 Bcl-2는 이중층과 막의 세포질 측면에 위치한 추정 기공 형성 영역을 포함한 나머지 폴리펩티드에 포함 된 나선 9가있는 막에 구성 적으로 결합됩니다. 그러나 세포 사멸 동안 Bcl-2 잔기 158, Bcl-2의 추정 기공 형성 도메인의 기저 근처에 위치한 시스테인은 수성 환경에서 소수성 환경으로 이동합니다 ( Kim et al , 2004). 이 관찰은 Bcl-2가 아폽토시스 동안 극적인 형태 변화를 겪는다는 것을 분명하게 나타내지 만, Bcl-2가 아폽토시스 유도의 다단계 과정에서 어디에서 활성인지는 밝히지 않았다. 최근 보고서에서 제안한 후보 단계 중 일부에는 활성화 된 BH3 단백질에 대한 결합 및 격리 또는 Bax 이동, 통합, 형태 변경 또는 올리고머 화 방지가 포함됩니다. 따라서 Bcl-2 구조적 변화의 기능적 중요성은 불분명합니다.
Bcl-2의 구조적 변화의 중요성을 이해하기 위해 Bcl-2와 세 가지 기능 장애 돌연변이 Bcl-2-G145A를 모두 조사했습니다 ( Yin et al , 1994 ; Sedlak et al , 1995 ; Ottilie et al , 1997 ). , Bcl-2-V159D 및 Bcl-2-S105C / E152C in transfected 세포 및 in vitro . 체외 사용하여Bax에 의한 막 투과를 조절하는 상호 작용이 태그없이 전장 단백질로 표현 된 최소한의 정제 된 재조합 또는 형질 감염된 성분으로 재구성 된 시스템을 통해 막에 관련된 분자 메커니즘을 조사 할 수 있었다. 우리의 결과는 Bcl-2와 Bax가 많은 이전 모델에서 예측 한대로 직접 상호 작용한다는 것을 시사 할뿐만 아니라 두 가지 모두 에서 예상치 못한 분자 메커니즘을 강력하게 제안 합니다.Bcl-2 및 Bax는 각각의 기공 형성 도메인이 안정적으로 상호 작용하기 전에 지질 이중층에 삽입되도록 구조를 변경해야합니다. 따라서 Bcl-2는 둘 다 다중 스패닝 막 관통 단백질 인 경우에만 막 결합 Bax의 올리고머 화를 방지합니다. Bax의 기공 형성 도메인을 막에 삽입하는 것이 막 투과성을위한 전제 조건이기 때문에 활성화 단계로 간주되는 것처럼, Bcl-2의 해당 구조 변화도 이러한 형태의 Bcl-2이기 때문에 '활성화'를 구성합니다. Bax에 의한 막 투과 억제 :이 형태를 채택 할 수없는 돌연변이 체는 Bax에 대해 비활성입니다. Conformationally 변경된 Bcl-2는 막 내장 Bax의 농도가 Bcl-2의 농도를 초과 할 때까지 계속해서 세포 사멸을 억제합니다. 함께,
결과 및 논의
비활성 돌연변이 Bcl-2-G145A 및 Bcl-2V159D는 세포 사멸 동안 막에서 토폴로지를 변경하지 않습니다.
돌연변이 G145A (Bcl-2-G145A)를 갖는 Bcl-2는 조혈 세포에서 성장 인자 박탈에 의해 유도 된 세포 사멸을 예방하지 못합니다. 더욱이 Bcl-2-G145A는 Bcl에 결합 할 수있는 Bax에서 입체 형태 변화를 유도하는 것으로 알려진 세제 조건을 사용하더라도 면역 침전 동안 Bax와 공침하지 않습니다 ( Yin et al , 1994 ; Lin et al , 2004 ). -2 ( Hsu and Youle, 1997 ). 더욱이, 우리는 최근 에 in vitro에서 합성 된 Bcl-2G145A가 재조합 Bax에 결합하지 않는다는 것을 보여 주었습니다 ( Zhang et al , 2004 ), 반대로 in vitro 합성 된 Bax는 재조합 Bcl-2-G145A에 결합하지 않습니다 (보충 그림 1 ). 따라서 Bcl-2-G145A가 기능하지 않는 이유 중 하나는 Bax에 결합 할 수 없기 때문입니다. 유사한 비 기능적 돌연변이 (G138A)는 Bcl-XL (BclX-G138A) ( Sedlak et al , 1995 )에서 생성되었으며 효모 2- 하이브리드 및 고체상 결합 분석에서 측정 된 막 관통 도메인이없는 Bax에 결합하지 않습니다. , 또는 형질 감염된 세포에서 발현 된 Bax ( 정 등 , 2004 ). 그러나 BclXL-G138A는 BH3 도메인을 포함하는 절단 된 Bax에 결합하고 ( Sedlak et al , 1995 ), 세포에서는 Bax BH3 도메인 단독에 의해 유도 된 세포 사멸에 여전히 결합하고이를 예방할 수 있습니다 ( Ottilie et al , 1997 년). 더욱이,이 잔기에서 알라닌 치환을위한 글리신은 Bcl-XL의 동종이 량체 화에 영향을 주지만 ( Jeong et al , 2004 ), Bcl-2에는 영향을 미치지 않습니다 ( Zhang et al , 2004 ). 이러한 상충되는 데이터는 아미노산 치환으로 인한 입체 장애 이외의 일부 구조적 제약이 Bcl-2-G145A가 전체 길이 Bax에 결합하고 세포 사멸을 억제하는 것을 방지 함을 시사합니다.
Bax와 동종이 량체 화 및 이종 올리고머 화를 매개하는 Bcl-2의 결합 표면에 대한 조사의 일환으로 ( Zhang et al , 2004 ), 우리는 비이 온성 세제에서 여전히 Bax에 결합하는 저 기능성 점 돌연변이 Bcl-2-V159D를 생성했습니다 ( 보충 그림 1 , 여기서 Bcl-2 및 돌연변이는 α9 나선 막 횡단 도메인없이 표현됩니다. 따라서 Bcl-2-G145A도 Bcl-2-V159D도 세포 사멸을 예방하지 못하더라도 Bax에 결합하는 정도가 다릅니다. Bcl-2-G145A 및 Bcl-2-V159D의 결함을보다 자세히 조사하기 위해 이들 단백질의 세포 사멸 유발 형태 변화를 이전에 세포 사멸을 예방할 때 Bcl-2에서 관찰 된 것과 비교했습니다 ( Kim et al , 2004).
인간 유방암 세포주 MCF-7 및 Rat-1myc ER TAM 세포 (여기서는 Rat-1 세포 ( Soucie et al , 2001 )라고 함)에서 Bcl-2는 다음과 비교하여 두 가지 다른 화학 요법 제에 의해 유도 된 세포 사멸을 상당히 지연시킵니다. Bcl-2-G145A 및 Bcl-2-V159D (그림 1A 및 B). Bcl-2-G145A에 대한 데이터는이 시점에서 온전한 세포가 남아 있지 않기 때문에 독소루비신으로 MCF-7 세포를 48 시간 처리하는 데 사용할 수 없습니다. Bcl-2-G145A 및 Bcl-2-V159D는 발현 세포의 반응이 벡터 대조군 세포와 다르지 않았기 때문에 이들 분석에서 비 기능적이었다 (데이터는 표시되지 않음).
<참고>
ww.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=140191
Bcl-2 단백질이 결장암 치료의 장애물인가?
아폽토시스(apoptosis)는 세포가 유전자에 의해 제어되어 죽는 방식으로 괴사나 병적인 원인으로 세포가 죽는 네크로시스(n...
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Bcl-2 단백질이 결장암 치료의 장애물인가?
의학약학 KISTI (2008-09-29)
아폽토시스(apoptosis)는 세포가 유전자에 의해 제어되어 죽는 방식으로 괴사나 병적인 원인으로 세포가 죽는 네크로시스(necrosis)와 구별된다. 아포토시스는 발생 과정에서 몸의 구성을 담당하고, 다 자란 후에는 불필요한 부분을 제거하여 항상성을 유지하는 역할을 한다. 그러나 만약 아폽토시스가 일어나야 하는 부분에서 일어나지 않거나, 과도한 세포 사멸이 일어날 경우, 각종 질병으로 이어지게 된다. 특히 아폽토시스 저항성은 결장암을 포함하여 여러 암들의 발달에 기여하는 동시에 아폽토시스 저항성은 화학요법제가 투여되는 진행성 암 환자들의 반응율도 낮게 만든다. 따라서 이들 저항성 암을 갖고 있는 환자들은 아폽토시스에 민감하도록 만드는 새로운 치료법이 필요하다.
Bcl-2 단백질은 아폽토시스 경로를 조절하는 단백질로 잘 알려져 있다. 아폽토시스는 세포 내의 여러 조절인자들의 일련의 활성 및 반응으로 완성되는데, Bcl-2는 이러한 일련의 과정의 비교적 상위 단계에서 조절하게 된다. Bcl-2라는 이름은 이 유전자의 염색체 변이에 의해 B 세포가 B-세포 림프종(B-cell lymphoma)에서 유도되는 현상이 발견되어 이렇게 명명되었다. Bcl-2 단백질은 지금까지 여러 계열이 밝혀졌는데, 아폽토시스를 촉진하여 항암효과를 높이는 Bax, Bak, Bim, Hrk, Noxa 등의 계열과 아폽토시스를 억제하여 항암효과를 낮추는 Bcl-xL, Bcl-W, Mcl-1, A1 등의 계열로 분류된다.
독일의 University of Mainz의 연구팀은 이전에 Bcl-xL과 Mcl-1과 같은 아폽토시스 저해 Bcl-2 계열 단백질이 결장암 세포에서 발현된다고 보고했다. 이들 단백질들은 아폽토시스 유도를 차단시키고, 그에 따라서 미토콘드리아 활성화도 막히게 된다. 미토콘드리아는 아폽토시스 신호전달경로의 중추기관이기 때문에, 미토콘드리아의 활성화는 결장암세포가 아폽토시스에 민감하게 만드는데 중심 역할을 한다. 최근에 표적 치료제와 같은 새로운 항암제들이 결장암 환자들은 수명을 늘려주는 효과가 입증되었다. 또한 결장암 세포에서 발현되는 TRAIL-R1과 TRAIL-R2와 같은 표적 사멸 수용체에 작용하는 물질들도 개발되고 있다. 그러나 연구팀은 환자들의 아폽토시스 저해 Bcl-2 계열 단백질의 활성을 낮추다면, 이들 결장암 치료제의 효과를 더 높일 수 있을 것으로 생각하고 연구를 진행했다.
‘World Journal of Gastroenterology’에 발표된 연구결과는 Bcl-2 단백질에 대한 의문점에 해답을 제시하고 있다. 연구를 주도한 Henning Schulze-Bergkamen 박사는 아폽토시스 저해 Bcl-2 단백질인 Bcl-xL가 주변의 다른 악성조직과 비교해서 결장암에서 현저히 많이 발현됨을 확인했다. 다른 아폽토시스 저해 Bcl-2 계열 단백질인 Mcl-1도 Bcl-2보다는 덜 했지만 주변의 악성조직보다는 많이 발현되었다고 한다. 연구팀이 RNA 간섭(interference) 기술을 이용하여 결장암 세포에서 Bcl-xL 발현을 억제하자 세포사멸이 유도되었다고 한다 또한 이들 세포들은 옥사플라틴(oxaliplatin), 이리노테칸(irinotecan), 5-FU와 같은 화학요법제, 세툭시맵(cetuximab)이나 PD168393과 같은 EGFR 수용체 차단 약물, CD95L과 TRAIL과 같은 사멸 수용체 리간드(death receptor ligands)의 투여에 의해서 더 쉽게 사멸되게 되었다. Mcl-1 억제 결장암 세포에서도 이들 약물의 효과가 높아졌다.
아폽토시스 저항성은 진행형 결장암 환자들의 치료에 큰 장애물로 여겨지고 있다. 이번 데이터는 Bcl-xL과 Mcl-1과 같은 아폽토시스 저해 Bcl-2 계열 단백질이 결장암에서 주요한 역할을 한다는 것을 보여주고 있다. 또한, Bcl-xL 또는 Mcl-1을 저해하는 약물의 개발은 기존의 화학요법제나 EGFR 수용체 차단제 및 사멸 수용체 리간드 등의 약물의 효과를 높여줄 것으로 기대되고 있다.
출처: [BRIC Bio통신원] Bcl-2 단백질이 결장암 치료의 장애물인가? ( https://www.ibric.org/myboard/read.php?Board=news&id=140191 )
<참고>
[암유전자] Bcl-2 돌연변이
Bcl-2 돌연변이 세포자멸사 억제유전자 패밀리(AIPs) [2] Bcl-2(B-cell lymphoma-2)는 바이러스 침입이 발생한 경우, 이를 제압하기 위해 백혈구 내에서 T-세포가 분비하는 사이토카인 면역 단백질의 하나
blog.daum.net
<참고>
Short name: Bcl2_BH4
Overlapping homologous superfamilies
H Blc2-like superfamily (IPR036834)
Description
Apoptosis, or programmed cell death (PCD), is a common and evolutionarily conserved property of all metazoans
[1]
. In many biological processes, apoptosis is required to eliminate supernumerary or dangerous (such as pre-cancerous) cells and to promote normal development. Dysregulation of apoptosis can, therefore, contribute to the development of many major diseases including cancer, autoimmunity and neurodegenerative disorders. In most cases, proteins of the caspase family execute the genetic programme that leads to cell death.
Bcl-2 proteins are central regulators of caspase activation, and play a key role in cell death by regulating the integrity of the mitochondrial and endoplasmic reticulum (ER) membranes
[2]
. At least 20 Bcl-2 proteins have been reported in mammals, and several others have been identified in viruses. Bcl-2 family proteins fall roughly into three subtypes, which either promote cell survival (anti-apoptotic) or trigger cell death (pro-apoptotic). All members contain at least one of four conserved motifs, termed Bcl-2 Homology (BH) domains. Bcl-2 subfamily proteins, which contain at least BH1 and BH2, promote cell survival by inhibiting the adapters needed for the activation of caspases.
Pro-apoptotic members potentially exert their effects by displacing the adapters from the pro-survival proteins; these proteins belong either to the Bax subfamily, which contain BH1-BH3, or to the BH3 subfamily, which mostly only feature BH3
[3]
. Thus, the balance between antagonistic family members is believed to play a role in determining cell fate. Members of the wider Bcl-2 family, which also includes Bcl-x, Bcl-w and Mcl-1, are described by their similarity to Bcl-2 protein, a member of the pro-survival Bcl-2 subfamily
[3]
. Full-length Bcl-2 proteins feature all four BH domains, seven alpha-helices, and a C-terminal hydrophobic motif that targets the protein to the outer mitochondrial membrane, ER and nuclear envelope.
Active cell suicide (apoptosis) is induced by events such as growth factor withdrawal and toxins. It is controlled by regulators, which have either an inhibitory effect on programmed cell death (anti-apoptotic) or block the protective effect of inhibitors (pro-apoptotic)
. Many viruses have found a way of countering defensive apoptosis by encoding their own anti-apoptosis genes preventing their target-cells from dying too soon.
All proteins belonging to the Bcl-2 family
[6]
contain either a BH1, BH2, BH3, or BH4 domain. All anti-apoptotic proteins contain BH1 and BH2 domains, some of them contain an additional N-terminal BH4 domain (Bcl-2, Bcl-x(L), Bcl-w), which is never seen in pro-apoptotic proteins, except for Bcl-x(S). On the other hand, all pro-apoptotic proteins contain a BH3 domain (except for Bad) necessary for dimerisation with other proteins of Bcl-2 family and crucial for their killing activity, some of them also contain BH1 and BH2 domains (Bax, Bak). The BH3 domain is also present in some anti-apoptotic protein, such as Bcl-2 or Bcl-x(L). Proteins that are known to contain these domains include vertebrate Bcl-2 (alpha and beta isoforms) and Bcl-x (isoforms (Bcl-x(L) and Bcl-x(S)); mammalian proteins Bax and Bak; mouse protein Bid; Xenopus laevis proteins Xr1 and Xr11; human induced myeloid leukemia cell differentiation protein MCL1 and Caenorhabditis elegans protein ced-9.
겹치는 동종 수퍼 패밀리
H Blc2 유사 수퍼 패밀리 ( IPR036834 )기술
세포 자멸사 또는 프로그램 된 세포사 (PCD)는 모든 후생 동물의 공통적이고 진화 적으로 보존 된 속성입니다.
[ 1 ]
. 많은 생물학적 과정에서 세포 사멸은 과다하거나 위험한 (예 : 전 암성) 세포를 제거하고 정상적인 발달을 촉진하기 위해 필요합니다. 따라서 세포 사멸의 조절 장애는 암,자가 면역 및 신경 퇴행성 장애를 포함한 많은 주요 질병의 발병에 기여할 수 있습니다. 대부분의 경우 카스파 제 계열의 단백질은 세포 사멸로 이어지는 유전 프로그램을 실행합니다.
Bcl-2 단백질은 카스파 제 활성화의 중심 조절 자이며 미토콘드리아 및 소포체 (ER) 막의 완전성을 조절하여 세포 사멸에 중요한 역할을합니다.
[ 2 ]
. 포유류에서 최소 20 개의 Bcl-2 단백질이보고되었으며 다른 여러 단백질이 바이러스에서 확인되었습니다. Bcl-2 계열 단백질은 대략 세 가지 하위 유형으로 나뉘는데, 이는 세포 생존을 촉진하거나 (항-아폽토시스) 세포 사멸을 유발합니다 (프로-아폽토시스). 모든 구성원은 Bcl-2 상 동성 (BH) 도메인이라고하는 4 개의 보존 된 모티프 중 하나 이상을 포함합니다. 적어도 BH1 및 BH2를 포함하는 Bcl-2 서브 패밀리 단백질은 카스파 제 활성화에 필요한 어댑터를 억제하여 세포 생존을 촉진합니다.
Pro-apoptotic 멤버는 pro-survival 단백질에서 어댑터를 대체하여 잠재적으로 효과를 발휘합니다. 이러한 단백질은 BH1-BH3를 포함하는 Bax 서브 패밀리에 속하거나 BH3 만 특징으로하는 BH3 서브 패밀리에 속합니다.
[ 3 ]
. 따라서 적대적인 가족 구성원 간의 균형은 세포 운명을 결정하는 역할을하는 것으로 믿어집니다. Bcl-x, Bcl-w 및 Mcl-1을 포함하는 더 넓은 Bcl-2 계열의 구성원은 생존 Bcl-2 하위 계열의 구성원 인 Bcl-2 단백질과의 유사성으로 설명됩니다.
[ 3 ]
. 전체 길이 Bcl-2 단백질은 4 개의 BH 도메인, 7 개의 알파 나선 및 외부 미토콘드리아 막, ER 및 핵 외피로 단백질을 표적으로하는 C- 말단 소수성 모티프를 특징으로합니다.
활성 세포 자살 (세포 자살)은 성장 인자 금단 및 독소와 같은 사건에 의해 유발됩니다. 그것은 프로그램 된 세포 사멸 (항 아폽토시스)에 대한 억제 효과를 갖거나 억제제의 보호 효과를 차단 (프로-아폽토시스)하는 조절기에 의해 제어됩니다.
. 많은 바이러스는 표적 세포가 너무 빨리 죽는 것을 방지하는 자체 항 세포 사멸 유전자를 암호화하여 방어 적 세포 사멸을 막는 방법을 찾았습니다.
Bcl-2 계열에 속하는 모든 단백질
[ 6 ]
BH1, BH2, BH3 또는 BH4 도메인을 포함합니다. 모든 항-아폽토시스 단백질은 BH1 및 BH2 도메인을 포함하며, 일부는 추가 N- 말단 BH4 도메인 (Bcl-2, Bcl-x (L), Bcl-w)을 포함하며, 이는 프로-아폽토시스 단백질에서는 볼 수 없습니다. Bcl-x (S)의 경우. 반면에 모든 pro-apoptotic 단백질은 Bcl-2 계열의 다른 단백질과의 이합체 화에 필요한 BH3 도메인 (Bad 제외)을 포함하며 이들의 살해 활성에 중요하며, 일부는 BH1 및 BH2 도메인 (Bax, Bak ). BH3 도메인은 Bcl-2 또는 Bcl-x (L)와 같은 일부 항-아폽토시스 단백질에도 존재합니다. 이러한 도메인을 포함하는 것으로 알려진 단백질에는 척추 동물 Bcl-2 (알파 및 베타 동형) 및 Bcl-x (동형 (Bcl-x (L) 및 Bcl-x (S)), 포유류 단백질 Bax 및 Bak, 마우스 단백질 Bid가 포함됩니다. Xenopus laevis 단백질 Xr1 및 Xr11;
<참고>
synapse.koreamed.org/upload/SynapseData/PDFData/0119jkma/jkma-50-1016.pdf
항암치료에 있어 Bax 단백질의 의의 Bax Protein in Cancer Treatment
서 론
세포자멸사(apoptosis)는 생리학적 성장조절 및 조직 항상성 유지에 필수적인 조절기전으로서 다양한 생 리학적 혹은 병리학적 상황에서 발생한다(1, 2). 세포자멸 사는 세포의 수축, 핵 DNA 분절, 핵막의 수포형성(blebbing)같은 특징적인 형태학적 혹은 생화학적 변화를 수반 한다(1, 2). 세포자멸사는 배아발생, 조직 항상성 유지, 병원 체에 대한 방어에 중요한 역할을 하며 이의 조절이상은 악 성 종양, 자가면역질환, 퇴행성 질환 등 다양한 질환을 초래 한다(1, 2). 또한 암치료의 주축이 되는 항암화학요법과 방 사선치료는 주로 암세포에서 세포자멸사를 초래함으로써 항암효과를 나타내기 때문에 세포자멸사 작용의 이상은 항 암치료에 있어 중요한 장애를 초래한다(1~ 4).
세포자멸사 과정에서 중요한 역할을 하는 대표적인 단백질이 Bax이며 Bax 단백질의 이상은 각종 암에서 불량한 예후를 예측하며 항암치료에 대한 저항성에 관여하는 것으로 보고되고 있다 (1~ 6). 본 의학강좌에서는 Bax 단백질의 작용 및 항암화학 요법 등 암치료에 있어 Bax 단백질 이상의 임상적 의의 등 에 대해 기술하고자 한다
세포자멸사의 기전 세포자멸사는 크게 외경로(extrinsic pathway) 혹은 사 멸수용체(death receptor) 경유 경로와 내경로(intrinsic pathway) 혹은 사립체(mitochondria) 경로로 대별된다 (1, 2).
두 경로 모두 세포자멸사 과정은 caspase라 하는 세 포내 cysteine protease에 의해 수행된다(1, 2, 5).
외경로 는 주로 Fas ligand 등 tumor necrosis factor 계열의 리간 드가 세포 표면의 사멸수용체에 결합한 후 Fas-associated death domain (FADD) 단백질 등 연결기 단백질을 경유하 여 caspase 8을 활성화시켜 세포자멸사를 유발한다(1, 2) (Figure 1).
내경로는 DNA 손상 등 외적 스트레스가 가해 지면 사립체 외막의 투과(permeabilization)에 의한 cytochrome-c의 유리 및 이에 수반되는 Apaf-1과 caspase-9 의 활성화에 의해 진행된다(1, 2).
두가지 경로에 의해 각각 활성화되는 caspase-8 및 9는 경로 하류(down-stream) 에 있는 수행 caspase (caspase-3, 6, 7)를 활성화시키며 이들은 세포단백질들을 절단하여 세포자멸사를 유도한다 (Figure 1)(1, 2). 일부 세포에서는 두 경로가 연결되어 있 는데 외경로에 의해 활성화되는 caspase-8은 세포자멸사 촉진작용을 지닌 Bid를 절단하여 활성화시키며 Bid는 내경 로를 경유하여 세포자멸사를 유발한다(Figure 1)(1, 2, 4).
항암제에 의한 세포자멸사 유도는 주로 내경로와 관여되는 것으로 알려져 있다.
내경로는 대부분 Bcl-2 계열 단백질에 의해 억제 혹은 활성화 되는데 내경로의 활성화에 하류에서 관여하는 대표적인 단백질이 Bax이다(1 ~ 6). Bcl-2 계열 단백질은 다음과 같이 세 가지로 구분되며 이 단백질들은 대체적으로 특정 부위의 아미노산 서열에 유사 성이 있고 이들 부위를 Bcl-2 Homology (BH1) 영역이라 하며 BH1, BH2, BH3, BH4로 분류된다(1~ 6).
① 세포생 존을 촉진시키는 단백질 (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, A1),
② Bcl-2와 유사한 구조, 특히 BH1, BH2, BH3 영역 의 구조적 유사성이 있고 세포자멸사 촉진작용을 하는 단백 질(Bax, Bak, Bok),
③ BH3 영역을 제외하고는 Bcl-2 혹은 동일 계열 단백질 상호간에 유사성이 거의 없으며 세포 자멸사 촉진 작용을 하는 BH3-only 단백질(protein) (Bik, Bad, Bid, Bim, Bmf, Hrk, Noxa, Puma) (1~ 6).
단백질
1. 인체에 있어서 Bax 단백질의 역할
Bax (Bcl-2 Antagonist X) 단백질은 1993년 Korsmeyer 등에 의해 보고되었으며 염색체 19번에 위치하며 분자량은 21 kilodalton이다(3, 7).
Bax 단백질은 발생과정중 신경세 포의 사멸, 림프계 및 생식기관의 항상성 유지, 종양 억제, DNA 손상에 이은 세포사, 허혈-재관류 손상 등에 관여하 는 것으로 알려져 있다(3, 8 ~12).
2. Bax 단백질의 세포내 작용기전
Bax 단백질은 주로 세포질에 존재하지만 DNA 손상 등 스트레스가 전해지면 사립체 외막으로 이동하여 이의 투과 를 유발하여 cytochrome-c를 유리시켜 세포자멸사를 유도 한다(1~ 6). Bax 등이 이러한 현상을 초래하는 정확한 기전 은 아직 확실하게 밝혀지지는 않았으나 사립체 외막에서 Bax 단백질들의 소중합체형성(oligomerization)에 의해 초래되는 것으로 알려져 있다(2, 3, 5).
3. Bax 단백질의 활성화 및 억제기전 (Figure 1)
(1) Bax 단백질의억제 Bax 단백질의 작용을 억제하는 대표적인 단백질은 Bcl2 및 Bcl-XL로서, 사립체 막에서의 Bax 단백질의 소중합체 형성을 억제하여 Bax 단백질의 작용을 방해하고 궁극적으 로 세포자멸사를 억제하여 세포생존을 촉진하게 된다 (1 ~ 6).
Bcl-2 계열 단백질 외에도 Ku70, humanin 등도 Bax에 대한 길항작용을 지닌 것으로 알려져 있다(3).
(2) Bax 단백질의활성화
Bax 단백질의 활성화에 가장 중요한 역할을 하는 것은 세포자멸사 경로 중 Bax 단백질 상류(upstream)에 위치한 BH3-only 단백질로서 세포에 스트레스가 가해지게 되면 BH3-only 단백질들은 직·간접적으로 Bax를 활성화시킨 다 (1~ 6, 13 ~ 15). BH3-only 단백질 중 Bid와 Bim은 주 로 Bax에 직접적으로 결합하여 활성화시키는 반면, Bad 등 나머지 BH3-only 단백질은 Bcl-2 등 세포생존촉진 단백 질에 결합하여 이들의 Bax 단백질 억제작용을 방해하여 간접적으로 Bax 단백질을 활성화시키는 것으로 알려져 있다 (2 ~ 5). 그런데 Bid와 Bim도 Bax와의 직접적 상호작용보 다는 세포생존촉진 단백질을 경유하여 Bax를 활성화시킨 다는 최근 연구 결과도 있다(16 ~ 18).
세포의 보호자 역할 을 하는 것으로 알려진 p53도 BH3-only 단백질의 전사촉 진 및 Bcl-2 계열 단백질의 억제를 유도하거나 Bax 단백질 을 직접적으로 활성화시켜 세포자멸사를 초래할 수 있다 (1 ~ 3, 19, 20). 그러나 Bax 단백질 활성화는 p53과 큰 연관 성이 없는 경우가 더 많다는 보고도 있다(2).
종양학 분야에 있어서 Bax단백질의 임상적 의의
1. 암 발생 Bax 단백질은 종양억제 단백질로 간주될 수 있어 이의 이상은 암의 발생과 관련이 있을 수 있으며 일부 동물실험 에서도 이를시사하는연구 결과가있다(1, 3). 그러나 Bax-/- 생쥐는 암 발생빈도가 크게 증가하지 않는 점 등을 고려할 때, 대체적으로 Bax 단백질의 소실 혹은 Bax 유전자의 돌 연변이는 암 발생과는 큰 관계는 없는 것으로 알려지고 있 으며 이는 Bax와 Bak의 세포자멸사에서의 작용이 상당부 분 중복되기 때문으로 생각된다(1, 2, 6).
2. Bax 단백질의 암 치료에의 이용 Histone deacetylase 억제제를 사용하여 Ku70의 과아 세칠화를 유도하여 Bax 단백질 억제를 해제시키는 시도, Bax 유전자를 종양에 주입하는 유전자치료, Bax 단백질을 직·간접적으로 활성화 시키는 Bid, Bim 등 BH3 영역 펩 타이드의 투여 등이, Bax 단백질의 암 치료에서의 이용의 대표적인 예들이나, 대부분 실험실적 연구가 진행되고 있으 며 실제 임상에서의 이용은 보다 많은 전임상 및 임상연구 를 거쳐야 할 것으로 보인다(1~ 3).
3. 예후인자 혹은 예측인자로서의 Bax 단백질 실제 임상에서는 Bax 단백질이 환자의 예후를 예측하는 예후인자(prognostic factor), 혹은 항암화학요법이나 방사 선치료 후 치료반응 및 경과를 예측하는 예측인자(predictive factor)로서의 역할이 가장 강조되고 있다(1, 2). 특히 etoposide, doxorubicin, cisplatin, paclitaxel 등 대부분 의 항암제들이 세포 중간대사의 이상을 유발하거나 p53이 나 ceramide 등 세포사멸유발 물질의 활성화 등을 통해 사 립체의 투과를 초래하여 Bax 단백질 등을 경유하여 세포자 멸사를 유도하게 된다(1, 2, 4). 따라서 Bax 단백질의 이상 은 항암화학요법에 대한 저항성을 초래하게 되어 궁극적으 로 불량한 예후와 연관되게 된다(1, 2, 4). 주요 암에서 Bax 단백질 발현의 예후 혹은 예측인자로서의 역할에 대한 연구 결과들은 아래와 같다
<참고>
| 문서암호 : www.kosen21.org 1. 자료명: The role of Bcl-2 family members in tumorigenesis 2. 저자: Vladimir Kirkin, Stefan Joos and Martin Znig 3. 출판사: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research 4. 출판날짜: 2004년 3월 5. 내용소개 세포사멸은 염증을 일으키지 않도록 프로그램되어 세포죽음을 일으키는 생리적 과정으로 생명체의 성장, 분화, 유해세포 제거와 같은 필수적인 생물학적 항상성 유지현상으로 암, 자가면역질환, 퇴행성신경질환 등 건강과 직접 관련되어 있다. 여기에는 수많은 단백질 인자들이 관여하고 있는데, 이들 중 약 20여개의 단백질을 포함하는Bcl-2 단백질 패밀리는 세포사멸 조절에 중요한 축으로 작용하고 있다. 본 보고서는 이 단백질 패밀리의 기능과 모델을 제시하고 암 치료에서의 적용가능성을 논하고 있다. 6. 분석자 서문 세포사멸(apoptosis)은 생명체의 삶과 죽음 및 노화 그리고 각종 질병에 대한 기본적인 의문들을 해결하는 중요한 실마리로 이미 많은 연구가 이루어져 있다. 실제로 본 논문 이외에도 이미 여러 편의 리뷰논문들이 출판되어 있으며 그 중에서 Cory와 Adams에 의해 작성된 논문(1)은 본 분석자가 읽어본 Bcl-2에 관한 어떠한 논문보다 잘 쓰여진 것으로 관심 있는 독자들이 읽어볼 만하다. Kirkin 등에 의해 작성된 본 논문은 많이 알려진 Bcl-2계 단백질에 대한 일반론으로부터 시작하여 여러 종류의 암과 형질전환 쥐들(transgenic mice)을 이용한 구체적인 예들을 나열하고 있다. 따라서 전반적인 내용은 여러 논문들에서 밝혀진 사실들의 열거가 대부분이지만 인상적인 부분은 언급된 내용을 바탕으로 임상적 응용성을 타진해 보고 또 가능성을 제시해 주고 있다는 것이 . 세포사멸과 세포의 성장 및 분화는 생체 내에서 그 항상성이 조절됨으로써 기본적인 생리현상들을 생명체가 유지할 수 있도록 하고 있는데 이것은 병적인 원인에 의한 세포괴사(necrosis)와 차별성을 갖는다. 종양형성(tumerigenesis)의 초기에 있어서 c-myc, c-fos, c-jun과 같은 종양유전자(oncogene)들은 세포의 성장을 더 이상 정상적으로 조절되지 못하도록 만들지만, 일종의 방어 기전인 세포사멸을 활성화시키기도 하여 저산소증(hypoxia), 시토카인(cytokine), 세포-세포 간 접촉(cell-cell contact) 등에 의해 결국 세포사멸을 유도한다. 하지만 종양세포는 생존을 위 세포사멸에 내성을 나타낼 수 있도록 돌연변이를 일으키게 되는데 이 때 중요한 기전으로 작용하는 것이 바로 Bcl-2(B-cell lymphoma 2)계 단백질들이다. 하지만 세포사멸에 대한 내성은 종양형성의 과정과 관계되는 것으로 본 논문에서도 암이 악성종양으로 발전하는 필요조건은 될 수 있지만 충분조건은 되지 못함을 암시하고 있다. 즉, 종양발생의 원인은 결국 다른데 있는 것으로 세포사멸 유도를 통한 임상적 접근은 대증치료에 국한되는 한계를 갖게 되는 것이다. 유전적 손상 이외에 널리 인식된 종양형성의 원인 중 하나는 바로 염증(inflammation)이다. 염증의 발생은 단핵구(monocyte), T 림프구, B 림프구, 비만세포(mast cell) 등의 여러 면역세포들이 복합적으로 작용하고 혈관민무늬근(vascular smooth muscle cell)의 성장조절의 실패도 큰 비중을 차지하고 있다. 이러한 염증은 시토카인과 각종 효소 등을 통해 암, 동맥경화, 자가면역질환 등을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 또한 심화될 경우 당뇨병이 유발되면 그로 인한 각종 합병증으로 인한 성인질병의 원인이 된다. 따라서 종양형성의 원인에 대한 접근이 보다 근본적인 치료를 유도할 수 있지만 본 논문에서는 그러한 통찰력까지는 제공하지 못하고 있고 세포자연사를 이용한 치료로 국한시켜 다루고 있다. 관심 있는 독자들은 최근 Nature지에 소개된 염증에 관한 일련의 논문들을 참고하는 것도 좋을 것이다(2-4). 구체적인 각론은 본문과 그 참고문헌을 통해 얻을 수 있으므로 본 분석에서는 Bcl-2계 단백질의 총론과 그 응용에 중심을 두고자 한다. ※ 이 자료의 분석은 한국과학기술연구원의 김성원님께서 수고해 주셨습니다. e-mail : timeium@kist.re.kr |
| KOSEN-코센리포트 |
| http://www.sciencedirect.com/science/journal/01674889 |
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